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本制品是一种使用Oligo(dT)₂₅包被的磁珠，可与mRNA等尾部的poly(A)互补配对，用于稳定、高效、便捷地直接从动物组织或培养的动物细胞中或从总RNA中快速分离纯化获得高纯度完整的带有poly(A)的mRNA等RNA的磁珠。本制品分离纯化的poly(A) RNA中也可包含带有poly(A)的lncRNA等，但通常主要为mRNA，因此也常被称为mRNA磁珠。

本制品磁珠粒径约为200nm，浓度约为5mg/mL。每mg磁珠偶联的Oligo (dT)₂₅约为300-400pmol，每mg磁珠可纯化约2～3μg mRNA等poly(A) RNA，即每毫升 磁珠可以纯化约10～15μg mRNA等poly(A) RNA。

使用Oligo(dT)25磁珠纯化的带有poly(A)的mRNA、lncRNA等，可直接应用于RT-PCR、qPCR、高通量测序、mRNA文库的构建、mRNA的m6A等修饰分析、固相cDNA文库构建、Northern blot分析、RACE等分子生物学实验，还可用于mRNA疫苗的研发，如mRNA疫苗的纯化、3' Poly A尾长度检测时Poly A尾短链的分离纯化等。

一个典型的哺乳动物细胞中，四种主要的大分子的质量和占比为：

大分子	含量	占比
RNA	~20pg	1%
DNA	~7pg	0.3%
protein	～500pg	20%
polysaccharide (多糖)	～2μg	78.7%

其中，信使RNA(messenger RNA，mRNA)约占总RNA质量的4%，核糖体RNA (ribosomal RNA，rRNA)约占80%。

组分	1mL	5mL	20mL	100mL
BalbMag Oligo(dT)25磁珠	1mL	5mL	20mL	100mL
说明书	1份

保存：2～8℃，有效期1年。

• BalbMag Oligo (dT)₂₅磁珠长期不使用时，可以-20℃保存，-20℃可以保存更长时间。
  
• 操作过程要严格保证无RNA酶和DNA酶污染。对于操作环境中RNase的去除，推荐使用核酸酶喷雾清除剂以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。
  
• 本制品的所用试剂和耗材都要求是RNase-free和DNase-free的，操作时应小心，避免被污染。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。如果可能有DNase污染，通常高温高压灭菌可以使DNase灭活。
  
• 分装或使用磁珠时，请适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。
  
• 磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象，可以在磁珠聚集后晃动管内液体，使挂壁的磁珠流下。
  
• 请使用推荐的样本量。如果样本量过大，可能造成磁珠聚集，会影响洗涤进而影响提取获得的mRNA纯度。发生磁珠聚集时，洗涤时需尽量分散磁珠，这样可有效改善提取效果。如果发生磁珠聚集现象，建议在后续实验中适当减少总样本量。
  
• 由于mRNA容易降解，提取获得的mRNA推荐尽快用于RT-PCR等后续实验。如果不能尽快使用，需要-80℃保存。

本制品的原理和主要操作流程如图1所示。BalbMag Oligo (dT)₂₅磁珠表面共价修饰了25聚dT序列即Oligo (dT)₂₅，当真核细胞、动植物组织的裂解液或提取的总RNA与BalbMag Oligo (dT)₂₅磁珠混合后，磁珠表面的寡聚dT序列与mRNA等3'端的poly(A)进行碱基配对而特异性结合，然后在外界磁场的作用下，磁珠与相应溶液可以快速而高效地分离，经洗涤充分去除杂质，最后用洗脱液将mRNA等从磁珠上洗脱下来，即可获得高纯度完整mRNA等带有poly(A)的RNA。

图1.Oligo(dT)₂₅磁珠(货号：YTB4634)用于mRNA提取的工作原理示意图。


本制品盒具有提取效果稳定、纯度高、速度快、操作便捷等优点。本制品的mRNA提取体系经过反复测试和优化，能分离纯化获得总RNA中90%以上的mRNA，能从10⁶个细胞中提取约0.1～1μg mRNA，20mg小鼠肝组织能提取约0.2～2μg mRNA，20mg小鼠肺组织能提取约0.1～1μg mRNA。仅需裂解、结合、洗涤、洗脱等简单的操作，整个纯化过程不超过15分钟即可完成。所有操作都在同一个离心管中完成，操作便捷。提取的total RNA使用本制品进行mRNA的纯化效果参考图2。

图2.本制品用于从总RNA中纯化mRNA的效果图。使用柱式动物RNA提取试剂盒提取293T细胞的总RNA，同时使用本制品进行mRNA的纯化，然后使用一步法荧光定量RT-PCR试剂盒(SYBR Green)进行qRT-PCR检测，使用Actin、B2M和GAPDH的三对内参引物对比总RNA (Total RNA)和纯化的mRNA的Ct值。图中可见mRNA纯化前后的Ct值基本一致，说明mRNA的纯化效果接近100%。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

• 准备工作：
  
  • 缓冲液的准备。根据实验需要配制相关缓冲液，参考配方如下配制：
    

    Binding Buffer	20mM Tris-HCl (pH7.5),1M LiCl,2mM EDTA
    Lysis Buffer	100mM Tris-HCl (pH7.5),500mM LiCl,10mM EDTA,1% LiDS,5mM DTT
    Washing Buffer I	10mM Tris-HCl (pH7.5),150mM LiCl,1mM EDTA,0.1% LiDS
    Washing Buffer II	10mM Tris-HCl (pH7.5),150mM LiCl,1mM EDTA
    Elution Buffer	10mM Tris-HCl (pH7.5)

    • 试剂和耗材的RNase-free要求参见注意事项；试剂在使用时平衡至室温，如有沉淀，可37℃预热10分钟。
  • 细胞样品的准备。
    
    • 贴壁细胞用PBS洗涤一次；悬浮细胞1000～2000×g室温离心5分钟，弃上清，用PBS洗涤一次。
      
    • 按照细胞量加入推荐的裂解液。通过移液器吹打多次，裂解细胞至溶液变粘稠。
      
    • 选做：加入溶液裂解液后样品可能会比较粘稠，可适当超声或使用1mL注射器反复抽吸打断基因组DNA从而使粘稠感消失。此操作会产生泡沫，但不影响mRNA的得率。
      
    • 4℃以14000×g离心5分钟，并将上清转移至一个新的离心管。上清可用于mRNA纯化，或保存在-80℃备用。
  • 动物组织样品的准备。
    
    • 取所需量的动物组织，置于液氮中研磨成粉末，立即加入推荐量的裂解液。也可将组织置于1.5mL离心管中，迅速加入推荐量的冰浴预冷的裂解液，用微型电动匀浆器匀浆，或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。
      
    • 4℃以14000×g离心5分钟，并将上清转移至一个新的离心管。上清可用于mRNA纯化，或保存在-80℃备用。
  • BalbMag Oligo (dT)₂₅磁珠的准备。
    
    • 将磁珠溶液从4℃冰箱取出，适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。参考下表，根据总RNA量和总细胞量或组织重量，取适量的BalbMag Oligo (dT)₂₅磁珠悬液至一洁净离心管中。
      

      Total RNA	Beads required	Washing Buffer II
      1～10μg	20μL	200μL each time
      10～30μg	40μL	200μL each time
      30～50μg	100μL	200μL each time

      
      

      Cell number	Tissue mass	Lysis Buffer	Beads	Washing Buffer I	Washing Buffer Ⅱ
      ＜5×105	＜5mg	100μL	20μL	500μL	500μL each time
      1～2×106	5～20mg	300μL	40μL	500μL	500μL each time
      3～5×106	20～50mg	600μL	100μL	500μL	500μL each time

      
      
    • 无论磁珠用量多少，按照每个样品200μL结合液的量，加入适量结合液洗涤磁珠，用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离30秒，去除上清。重复本步骤1次。
      
      • 如果样品数量超过5个，可以考虑将适量磁珠悬液先直接置于磁力架上分离30秒，去除上清，然后根据样品数量再加入适量结合液洗涤2次。
    • 按照每个样品100μL结合液的量，加入适量溶液结合液重悬磁珠。
• 从细胞或组织样品中分离纯化mRNA：
  
  • 取上述制备好的细胞或组织样品与100μL洗涤后重悬的磁珠在室温下旋转混合5分钟。
    
  • 置于磁力架上分离1分钟，去除上清。
    
  • 室温下用500μL洗涤液I洗涤磁珠，磁分离30秒，去上清。
    
  • 室温下用500μL洗涤液Ⅱ洗涤磁珠，磁分离30秒，去上清。重复本步骤1次。
    
  • 根据后续实验需求，进行mRNA的洗脱：
    
    • 从磁珠上洗脱mRNA：加入10～20μL洗脱液或Nuclease-free的水，如DEPC水或无菌无酶超纯水，75～80℃孵育2分钟，磁分离30秒，然后将上清转移到新的Nulcease-free的离心管中，置于冰上待用。
      • 建议转移上清时保留少量液体以免吸到磁珠影响后续实验。纯化获得的mRNA极易降解，建议尽快进行后续实验。短时间内不使用，请置于-80℃保存。
    • 如果mRNA不洗脱直接用于后续实验，如固相cDNA文库构建等，用500μL洗涤液Ⅱ洗涤一次，再用后续实验中相应的缓冲液再洗涤一次，即可用于后续实验。
• 从Total RNA中纯化mRNA：
  
  • 取100μL含有20μg Total RNA的样品与100μL结合液混合。
    
    • 如果20μg Total RNA不足100μL，可以用DEPC水或其它适当Nuclease-free溶液补足至100μL。
  • 65℃孵育2分钟以打开RNA的二级结构，孵育结束后迅速置于冰上。
    
  • 将该200μL混合液与100μL洗涤后重悬的磁珠在室温下旋转混合5分钟。
    
  • 置于磁力架上分离1分钟，去除上清。
    
  • 室温下用200μL洗涤液Ⅱ洗涤磁珠，磁分离30秒，去上清。重复本步骤1次。
    
  • 根据后续实验需求，进行mRNA的洗脱：
    
    • 从磁珠上洗脱mRNA：加入10～20μL洗脱液或Nuclease-free的水，如DEPC水或无菌无酶超纯水，75～80℃孵育2分钟，磁分离30秒，然后将上清转移到新的Nulcease-free的离心管中，置于冰上待用。
      
      • 建议转移上清时保留少量液体以免吸到磁珠影响后续实验。纯化获得的mRNA极易降解，建议尽快进行后续实验。短时间内不使用，请置于-80℃保存。
    • 如果mRNA不洗脱直接用于后续实验，如固相cDNA文库构建等，用后续实验中相应的缓冲液再洗涤一次，即可用于后续实验。

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